Metodele PCR utilizate pentru determinarile de biologie moleculara
Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta. Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: - ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare; - enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq (izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza – pentru o tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN complementar - ADNc- cat si amplificarea ADNc); - cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+; - primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide, care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor; servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata; - deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ); - amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul sau ARN-ul tinta. Reactia PCR se desfasoara in 3 etape: 1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94șC, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene; 2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70șC, primerii se vor atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene; 3. Elongatia: la temperatura de 72șC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN. La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze: - Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei); - Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze; - Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta. Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR). Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza precoce a reactiei, respectiv in faza de crestere exponentiala a amplificarii, cand se produce o dublare exacta a cantitatii de amplicon la fiecare ciclu; detectia in acest moment este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza mai bine cu nivelul initial al tintei, comparativ cu tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze; - domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor); - limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C. In laboratorul Synevo cele 2 tipuri de metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste: - Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C; analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei; - PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV). Determinarea cantitativa a viremiei - vom descrie in acest document etapa de determinare a incarcaturii virale B, cu mentiunea ca recent in laboratorul nostru s-a trecut de la tehnologia conventionala PCR la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea automata a probelor. Particularitatea o constituie metoda de detectie a produsului PCR, care este cuantificat in cursul desfasurarii reactiei (‘in timp real”) prin monitorizarea fluorescentei emise la fiecare ciclu de amplificare, spre deosebire de detectia colorimetrica care avea loc la sfarsitul reactiei, in tehnologia conventionala. Testele de determinare a viremiei VHB se bazeaza pe 2 procese majore: - pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB; - amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei. Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei, amplificare PCR si detectie, ca si secventa tinta. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN-ul tinta, dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale. Extractia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnica de captura la suprafata unor bilute magnetice de sticla. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatura ridicata cu o proteaza si un tampon care elibereaza acizii nucleici si ii protejeaza de actiunea DNA-zelor din plasma. In fiecare proba este introdus ADN QS intr-o concentratie cunoscuta, impreuna cu proteaza, agentul lizant si bilutele de sticla. Dupa ce are loc incubarea amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captati la suprafata bilutelor de sticla, in timp ce substantele nelegate vor fi indepartate printr-un proces de spalare. Dupa incheierea etapei de spalare, acizii nucleici adsorbiti vor fi eluati cu o solutie apoasa la temperatura inalta. Proba procesata, ce include bilutele de sticla impreuna cu ADN VHB si ADN VHB QS, va fi adaugata amestecului de amplificare si transferata in analizorul in care vor avea loc amplificarea si detectia. In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye” Q). Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa Citeste mai mult
