Metode utilizate in microbiologie
Frotiul Depistarea rapida a microorganismelor si studiul morfologiei necesare unui diagnostic microbiologic corect se realizeaza prin examen microscopic. Examenul microscopic poate fi proaspat, intre lama si lamela sau fixat si colorat. Prin frotiu se intelege material microbian (produs patologic sau cultura microbiana) etalat in strat subtire pe suprafata unei lame de microscop. Pentru efectuarea unui frotiu se folosesc lame de microscop curate si degresate care se marcheaza la una din extremitati cu numele pacientului si materialul microbian ce urmeaza a fi etalat. Pentru fiecare produs patologic obisnuit se efectueaza 2 frotiuri (exceptie fac lichidele de punctie din care se fac 4 frotiuri), unul se coloreaza Gram (pentru evidentierea bacteriilor), iar al doilea Giemsa (pentru celularitate). Frotiul din produs patologic poarta denumirea de examen microscopic colorat si are un rol deosebit in bacteriologia medicala. El ajuta in: - orientarea catre un diagnostic rapid in caz de urgenta medicala (ex.meningita bacteriana); - orientarea microbiologului in respingerea unor produse patologice necorespunzatoare (ex.saliva, in loc de sputa); - corelarea dintre acesta si cultura, ce permite trecerea de la diagnosticul prezumtiv la diagnosticul de certitudine. Aproape toate bacteriile cu importanta clinica pot fi detectate la examenul microscopic colorat, exceptie facand: acele bacterii care traiesc aproape exclusiv intracelular e.g. Chlamydia, cele care se gasesc in peretele celular (ex.Mycoplasma si Ureaplasma) si cele care au dimensiuni insuficiente pentru a fi vizualizate la microscop (ex.spirochetele). Coloratiile folosite in bacteriologie sunt: 1. Coloratiile simple - utilizeaza un singur colorant si evidentiaza doar morfologia microbilor: dimensiune, forma, gruparea celulelor, prezenta capsulei. Dintre coloratiile simple, uzuala si rapida este coloratia cu albastru de metilen care coloreaza in albastru toate elementele celulare: bacterii, leucocite, celule epiteliale. 2. Coloratiile diferentiale - evidentiaza in afara caracterelor morfologice si reactiile de culoare ale microbilor. Coloratia Gram si coloratia Ziehl-Neelsen (Z.N.) sunt cele mai utilizate in bacteriologie.Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia Gram tine de diferentele structurale ale peretelui bacterian. Bacteriile Gram-pozitive apar colorate in violet, iar cele Gram-negative in rosu. Leucocitele si celulele epiteliale apar cu citoplasma colorata in roz si nucleul in rosu. Coloratia Ziehl-Neelsen este folosita pentru identificarea urmatoarelor grupe de bacterii: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella si oochistii de Cryptosporidium, Isopora, Sarcocystis si Cyclospora.Uzual in bacteriologie coloratia Z.N. este folosita pentru decelarea Mycobacteriilor. Acestea, spre deosebire de alte bacterii, datorita prezentei in peretele bacterian a unor substante ceroase, se coloreaza la cald cu fucsina bazica si rezista la decolorarea cu acizi minerali diluati si cu alcool. Bacilii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, iar bacteriile neacido-rezistente apar colorate in albastru la fel ca leucocitele si celulele tisulare, a caror citoplasma se coloreaza in albastru deschis cu nucleul albastru inchis. In timp s-au dezvoltat numeroase modificari de la metoda originala descrisa de Ziehl in 1882 si Neelsen in 1883, cea mai utilizata fiind cea descrisa de Kinyoun. 3. Coloratii speciale pentru structuri particulare ale unor bacterii (capsula - tus India; granulatii metacromatice - Del Vecchio, spori-verde malachit). Controlul intern de calitate al frotiurilor este obligatoriu si se face cu martor pozitiv si negativ.In cazul coloratiei Gram folosim urmatorii martori: - martor pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC 25923; - martor negativ: Escherichia coli ATCC 25922. Cultura Bacteriile apartinand unor specii diferite pot avea caractere microscopice asemanatoare, de aceea identificarea lor presupune si studiul caracterelor fiziologice care sunt cercetate "in vitro" pe medii de cultura. Cultura bacteriana reprezinta rezultatul cresterii si multiplicarii bacteriilor intr-un mediu nutritiv si are ca scop:- izolarea microorganismelor patogene din prelevatele patologice; - identificarea agentilor patogeni; - testarea sensibilitatii la antibiotice in vederea initierii si monitorizarii terapiei antimicrobiene. Clasificarea mediilor de cultura poate fi in functie de: 1. Tolerabilitate: - medii uzuale, care permit cresterea unui numar mare de specii bacteriene; - medii speciale, care permit cresterea unei game restranse de specii, uneori chiar tintit pentru o singura specie. 2. Scopul utilizarii: - medii de imbogatire (intotdeauna lichide) pentru anumite grupe de bacterii; - medii de izolare: uzuale, nediferentiale, diferentiale, care diferentiaza printr-un singur caracter grupe taxonomice sau tulpini; - medii selective, care inhiba unele grupe bacteriene favorizand multiplicarea altora. 3. Identificare:- medii test - conventionale sau microtest; - medii multitest - asociate sau combinate. Pentru fiecare categorie de prelevate patologice se utilizeaza uzual un mediu sau un set de medii care permit izolarea bacteriilor cel mai frecvent implicate in infectiile zonei respective. Acest set de medii uzuale poate fi suplimentat cu alte medii in raport cu datele clinico-epidemiologice. Pentru izolarea germenilor patogeni din produse pluricontaminate, este obligatorie insamantarea pe medii diferentiale. In cazul in care se apreciaza ca prelevatul contine un numar redus de germeni, se vor folosi medii lichide de imbogatire (bulion BHI pentru germeni aerobi, bulion thioglycolat cu resazurina pentru anaerobi, bulion selenit pentru coprocultura etc). Incubarea mediilor insamantate se face tinand cont de exigentele bacteriilor suspectate: - bacteriile aerobe se cultiva in atmosfera obisnuita; - bacteriile carboxifile necesita incubarea in atmosfera de CO2, aceasta realizandu-se in exicator cu ajutorul unei lumanari; - bacteriile strict anaerobe sunt cultivate cu ajutorul sistemelor Gaspak. Majoritatea bacteriilor de interes medical cresc adecvat la 37șC, spre deosebire de fungi a caror crestere este optima la 30șC. Urmarirea placilor incubate se face 24 - 48 de ore pentru bacteriile obisnuite; 2-5 zile pentru fungi. Examinarea culturilor Aspectul culturii este dependent de specie si de compozitia mediului. In mediu lichid cresterea poate fi: uniforma, cu depozit, granule, pelicula, inel, degajare gaz, formare de pigment. Pe mediile solide bacteriile formeaza colonii, caracterul acestora (forma, marime, suprafata, opacitate, consistenta, miros) si cantitatea in care s-au dezvoltat (+,++,+++,++++) orientand microbiologul catre diagnostic. Un aspect important il reprezinta absenta cresterii bacteriene in cazul produselor de obicei pluricontaminate (ex. exsudat nazofaringian, coprocultura, secretie vaginala). Acest lucru sugereaza faptul ca pacientul se afla sub tratament cu antibiotic sistemic sau local (ovule, antiseptice orofaringiene). Semnificatia clinica a unor izolate poate fi stabilita inca din primocultura, in cazul izolatelor din prelevate necontaminate (lichide de punctie) sau bacilii Gram-negativi izolati dincolo de un anumit prag in urocultura cantitativa. In cazul culturilor monobacteriene izolate din prelevate normal sterile (hemocultura, lichide de puncti Citeste mai mult
